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    專家教你攻克植物樣本
    作者:管理員 點擊:2022次 日期:2017-06-30 00:00:00.0    [] [] []

    相信大家在研究過程中總會遇到一些「奇葩」樣本,他們就像攔路虎一樣,總是在找我們的麻煩。不是提取得率低,就是降解,又抑或是有雜質殘留。這些樣本躲又躲不開,繞又繞不過,提還提不出來簡直就是煩死個人!

    其實沒那么復雜,靜下心來仔細思考一下提取過程就能理出一條線索,解決這個問題。首先是樣本的裂解或者破碎,很多疑難樣本在這一步就已經擋在了我們的面前,比如某些植物的根部以及較為堅韌的莖部等。這些樣本破碎起來特別困難,尤其是當大量樣品需要處理的時候,我們經常會選擇通量較高的鋼珠打樣器,當然還有傳統的液氮研磨,但這兩種方法要么費時間,要么打不透,這個時候我們就需要一些新的思路,比如使用纖維素酶或者果膠酶處理,電動組織研磨器等等。

    破碎之后我們需要裂解細胞,目前常用的方法有 SDS(十二烷基硫酸鈉)法和 CTAB(十六烷基三甲基溴化銨)法,SDS 法比較溫和,容易保證 DNA 的完整性,而 CTAB 法則較為強烈,當植物樣本成分復雜,多糖多酚含量較高時,一般會選用 CTAB 來進行裂解。

    而核酸沉淀則一般使用乙醇或異丙醇,乙醇是首選的有機試劑,對鹽類沉淀少,DNA沉淀中所含的痕量乙醇易于揮發。乙醇沉淀核酸時需要加NaAc,或NaCl至最終濃度0.1-0.25 M,中和核酸的電荷有助于核酸形成沉淀。而異丙醇沉淀所需容積小,沉淀速度快。但易使鹽類與核酸共沉淀,在核酸沉淀中異丙醇不易揮發。大家可以根據自己的需要來調整。

    在保存核酸的時候需要注意,核酸為兩性解離分子,在堿性條件下較穩定,一般用TE(pH 8.0)保存。為避免核酸降解,提取的核酸應先分裝,然后置于-80℃保存,此條件下可保存5年以上,同時避免反復凍融。

    我們來看幾個比較難提的樣本,首先是茶樹。我們要提的是茶樹根中的基因組,而且是多年生的老根。這種樣本木質化極為嚴重,非常堅硬難以破碎,次級代謝產物如多糖多酚含量較高,DNA含量較低。解決方案基本思路是利用液氮研磨,CTAB裂解,裂解液中NaCl的量翻倍,并加入了PVP,盡量減小酚類對核酸的影響。同時,由于根部細胞木質化嚴重,核酸含量較少,為了更大效率的獲得核酸,我們用了硅基質膜包裹的磁珠,就是這樣。最后我們得出的結果是這樣的。

    圖1 茶樹根提取結果

    火龍果的果皮是一種較為多糖多酚含量較高的樣本,同時由于存在大量果膠和纖維蛋白,導致樣本磨碎形成勻漿之后極為粘稠。這種粘稠的形態會極大影響裂解液對于吸附柱的通過率,甚至于堵住硅基質膜難以離心。同時,粘稠的樣本會降低柱膜對裂解液中核酸的吸附效率,所以需要解決的主要問題就是降低其粘稠性。通過大面積的調整試劑,利用TIANGEN已有的裂解液HL配合CTAB,并向其中加入了少量蛋白酶K,大大降低了溶液粘稠度,可以順利地從柱膜上洗脫,結果如下。

    圖2 火龍果果皮提取結果

    下面還有一些我們對其他樣本提取的建議。

    小麥種子:樣品影響DNA提取質量的因素有很多,主要為蛋白質、多酚、多糖、脂質等。措施:向傳統SDS 提取液中加入DTT和可溶性PVP,用醋酸鈉替代氯化鈉降低pH值。SDS置于65度預熱,裂解時放置于65度。

    果肉:含水量較大,核酸得率低,果肉中水解酶以及核酸酶大量累積易降解,蛋白質,糖、酚含量較高。措施:脫水或加大樣本量,充分研磨??墒褂肅TAB提取,提取時向裂解液中加入少量β-巰基乙醇,加入NaAc降低裂解液pH保證提取環境。

    葉綠體:葉綠體是綠色植物進行光合作用的細胞器,作為半自主系統具有DNA,需要去除其他部分提取。措施:蔗糖密度梯度離心法、Percoll 密度梯度離心法。利用不同密度的離心梯度液分離,利用常規SDS法提取DNA。

    TIANGEN公司作為國內核酸提取領域的龍頭企業,積累了大量的核酸提取經驗,我們將為各類提供最專業的服務。

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