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    WB整體實驗方法
    作者:管理員 點擊:2487次 日期:2017-05-02 00:00:00.0    [] [] []

    印跡法(blotting)是指將樣品轉移到固相載體上,而后利用相應的探測反應來檢測樣品的一種方法。1975年,Southern建立了將DNA轉移到硝酸纖維素膜(NC膜)上,并利用DNA-RNA雜交檢測特定的DNA片段的方法,稱為Southern印跡法。而后人們用類似的方法,對RNA和蛋白質進行印跡分析,對RNA的印跡分析稱為Northern印跡法,對單向電泳后的蛋白質分子的印跡分析稱為Western印跡法,對雙向電泳后蛋白質分子的印跡分析稱為Eastern印跡法。

    蛋白質印跡法首先是要將電泳后分離的蛋白質從凝膠中轉移到硝酸纖維素膜上,通常有兩種方法:毛細管印跡法和電泳印跡法。毛細管印跡法是將凝膠放在緩沖液浸濕的濾紙上,在凝膠上放一片硝酸纖維素膜,再在上面放一層濾紙等吸水物質并用重物壓好,緩沖液就會通過毛細作用流過凝膠。緩沖液通過凝膠時會將蛋白質帶到硝酸纖維素膜上,硝酸纖維素膜可以與蛋白質通過疏水相互作用產生不可逆的結合。這個過程持續過夜,就可以將凝膠中的蛋白質轉移到硝酸纖維素膜上。但這種方法轉移的效率較低,通常只能轉移凝膠中一小部分蛋白質(10%~20%)。電泳印跡可以更快速有效的進行轉移。這種方法是用有孔的塑料和有機玻璃板將凝膠和硝酸纖維素膜夾成“三明治”形狀,而后浸入兩個平行電極中間的緩沖液中進行電泳,選擇適當的電泳方向就可以使蛋白質離開凝膠結合在硝酸纖維素膜上。

    轉移后的硝酸纖維素膜就稱為一個印跡(blot),用于對蛋白質的進一步檢測。印跡首先用蛋白溶液(如10%的BSA)處理以封閉硝酸纖維素膜上剩余的疏水結合位點,而后用所要研究的蛋白質的抗血清(一抗)處理,印跡中只有待研究的蛋白質與一抗結合,而其它蛋白質不與一抗結合,這樣清洗去除未結合的一抗后,印跡中只有待研究的蛋白質的位置上結合著一抗。處理過的印跡進一步用適當標記的二抗處理,二抗是指一抗的抗體,如一抗是從鼠中獲得的,則二抗是抗鼠Ig G的抗體。處理后,帶有標記的二抗與一抗結合,可以指示一抗的位置,即是待研究的蛋白質的位置。

    目前有結合各種標記物的抗特定Ig G的抗體可以直接購買作為標記的二抗。最常用的一種是酶連的二抗,印跡用酶連二抗處理后,再用適當的底物溶液處理,當酶純化底物生成有顏色的產物時,就會產生可見的區帶,指示所要研究的蛋白質的位置。在酶連抗體中使用的酶通常是堿性磷酸酶或辣根過氧化物酶。堿性磷酸酶可以將無色的底物5-溴-4-氯吲哚磷酸鹽(BCIP)轉化為藍色的產物;而辣根過氧化物酶可以以H2O2為底物,將3-氨基-9-乙基咔唑氧化成褐色產物或將4-氯萘酚氧化成藍色產物。另一種檢測辣根過氧化物酶的方法是用增強化學發光法,辣根過氧化物酶在H2O2存在下,氧化化學發光物質魯米諾(luminol,氨基苯二酰一肼)并發光,在化學增強劑存在下光強度可以增大1000倍,通過將印跡放在照相底片上感光就可以檢測辣根過氧化物酶的存在。

    除了酶連二抗作為指示劑,也可以使用其它指示劑,主要包括以下一些:

    I125標記的二抗:可以通過放射性自顯影檢測。

    熒光素異硫氰酸鹽標記的二抗:可以通過在紫外燈下產生熒光來檢測。

    I125標記金黃色葡萄球菌蛋白A(Protein A):Protein A可以與Ig G的Fc區特異性的結合,因此Protein A可以代替二抗:I125標記的Protein A通過放射性自顯影檢測。

    金標記的二抗:二抗通過微小的金顆粒包裹,與一抗結合時可以表現紅色。

    生物素結合的二抗:印跡用生物素結合的二抗處理后,再用堿性磷酸酶或辣根過氧化物酶標記的凝集素處理。生物素可以與凝集素緊密結合,這種方法實際上相當于通過生物素與凝集素的緊密結合將二抗與酶連接,通過酶的顯色反應就可以進行檢測。這種方法的優點是由于生物素是一個小分子蛋白,一個抗體上可以結合多個生物素,也就可以結合多個酶連接的凝集素,可以大大增強顯色反應的信號。

    除了使用抗體或蛋白作為檢測特定蛋白的探針以外,有時也使用其它探針如放射性標記的DNA,可以檢測印跡中的DNA結合蛋白。


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